Tehnici orientative de lucru pentru prelucrarea si colorare a preparatelor citopatologice si histopatologice

 Ministerul Sănătății

Ordin nr. 1217 din 2010 

PRINCIPII GENERALE DE TEHNICA HISTOPATOLOGICA

Principiul tehnicii histopatologice impune transformarea unui prelevat dintr-un organ sau ţesut dintr-o masa tisulară opacă într-un preparat fin, translucid care permite vizualizarea microscopica a detaliilor structurale tisulare. Pentru a realiza aceasta prelevatul suferă transformări succesive:

1. Fixarea – previne alterarea si autoliza ţesutului
2. prelucrarea histopatologică (deshidratare, clarificare şi impregnare cu parafină)
3. Includerea in bloc de parafina
4. Secţionarea la microtom a prelevatului inclus in parafina
5. Etalarea secţiunilor pe lame (obţinerea preparatului histopatologic necolorat)
6. Colorarea lamelor
7. Montarea lamelor – permite protecţia si conservarea preparatului histopatologic colorat

Produs final – preparatul histopatologic permanent care permite interpretarea corecta in vederea stabilirii diagnosticului anatomo-patologic.

Protocoalele de lucru histopatologie sunt orientative; pot fi folosiţi reactivi diferiţi, timpul de acţiune şi concentraţiile menţionate în reţete sunt orientative şi se adaptează în funcţie de condiţiile locale (temperatură ambientală, duritatea şi pH-ul apei de robinet etc). Tehnica folosită este considerată corectă dacă se obţin rezultatele preconizate prin coloraţia respectivă. La reţetele de coloraţii recomandate sunt admise variaţii, în funcţie de structura care se doreşte evidenţiată; de asemenea, pot fi folosite alte coloraţii speciale pentru evidenţierea aceleiaşi structuri (de exemplu coloraţie pentru colagen Roşu Sirius, coloraţie mixtă uzuală şi pentru colagen – Hematoxilină eozină safran, mucicarmin pentru mucopolizaharide acide, auramină pentru bacili acid alcoolorezistenţi şi altele asemenea) sau coloraţii speciale pentru substanţe care nu pot fi identificate prin procedeele recomandate (de exemplu coloraţie von Kossa pentru calciu, coloraţie Scharlach, Sudan III, negru Sudan sau roşu ulei O pentru lipide, coloraţie cu rodanină pentru depozite de cupru şi altele asemenea).

Pentru tehnicile de imunohistochimie timpul de expunere la anticorpi primari şi secundari poate fi modificat în funcţie de diluţia anticorpului; de asemenea metodele de pretratament pot fi modificate faţă de recomandarea producătorului (de exemplu fierbere în tampon citrat în loc de tratament enzimatic pentru pancitokeratina AE1-AE3) cu condiţia obţinerii de rezultate concordante cu structurile evidenţiate pe lame martor.

PROTOCOL DE LUCRU

prelucrarea pieselor anatomo-patologice (piese chirurgicale, biopsii, fragmente tisulare recoltate la necropsii)

1. Verificarea documentelor de insotire a materialului bioptic; se va verifica daca pe fisa de insotire sunt trecute corect numele si prenumele pacientului, varsta, numarul foii de observatie, sectia care solicita examenul histopatologic, diagnosticul clinic prezumptiv, denumirea materialului bioptic trimis, data recoltarii, fixatorul utilizat, semnatura si parafa medicului care solicita diagnosticul histopatologic, numele si semnatura celui care a adus materialul bioptic/citologic
2. Verificarea materialului bioptic. Se va verifica daca materialul bioptic/citologic este in recipient. Se va verifica daca materialul bioptic este adus fixat (in formol sau alta substanta fixatoare) sau este proaspat. Se va verifica daca din punct de vedere calitativ materialul bioptic/citologic nu este corespunzator (dimensiuni foarte mici si/sau cu arii intinse de necroza).se va verifica concordanţa ei documentelor de insotire a materialului bioptic – recipient material bioptic
3. Inregistrare – acordarea de numar/caz; unui caz se poate acorda unul sau mai multe numere; dacă unui caz i se acordă un singur număr şi în cursul orientării macroscopice se recoltează mai multe fragmente, acestea vor fi etichetate individual cu numere sau litere suplimentare (de exemplu număr caz 1000 din care se prelevează 3 fragmente cu numărul 1000/1, 1000/2 şi 1000/3 sau 1000/A, 1000/B şi 1000/C); înregistrarea cazului se poate face înainte sau în cursul orientării macroscopice
4. Orientare macroscopică / fasonare – descrierea pieselor, secţionarea lor şi recoltarea de fragmente pentru prelucrare histopatologică în concordanţă cu particularităţile fiecărui caz; orientarea macroscopică se poate face fie pe piese proaspete (nefixate), fie după o fixare prealabilă de 24-72 ore
5. Fixare – în formol 10% tamponat, minimum 24h; timpul de fixare poate fi redus în funcţie de timpul de fixare prealabilă (anterioară orientării macroscopice) a fragmentelor tisulare
6. Decalcifiere – dacă se recoltează fragmente osoase sau calcificate
7. Prelucrare histopatologică pe baterie manuală sau procesare automată (histochinetă, histoprocesor, autotehnicon); etapele prelucrării histopatologice diferă în funcţie de tipul de ţesut prelucrat, reactivii preferaţi şi de aparatura existentă; cel mai frecvent se folosesc agenţi de deshidratare (alcool etilic, eventual acetonă, alte substanţe asemenea), agenţi de clarificare (alcool izopropilic, alcool amilic, benzen, toluen, xilen sau alte substanţe asemenea), impregnare cu parafină; perioada de procesare variază între 17 ore (procesare automată) şi 5 zile lucrătoare (procesare manuală)
8. Includere in parafină; dacă se formează blocuri de parafină, acestea vor fi fasonate şi etichetate; dacă se include pe casete, casetele vor fi fasonate şi se va verifica etichetarea acestora

     9 .Sectionarea blocurilor de parafina la microtom.

10. Etalarea secţiunilor pe lame
11. Deparafinarea şi rehidratarea lamelor; se va efectua prin treceri prin băi succesive de agent de deparafinare (benzen, toluen, xilen sau alte substanţe asemenea), alcool etilic şi apă de robinet; numărul băilor şi timpul de expunere variază în funcţie de desfăşurarea manuală sau automată a procesului (minimum 25 de minute – automat, 1 oră – manual)
12. Colorare   după reţeta coloraţiei respective

   17.Deshidratare (eventual uscare), clarificare (benzen, toluen, xilen sau          alte substanţe asemenea),

   18.Montare (cu mediu de montare)

    19.Etichetare.

PROTOCOL DE LUCRU / CITOLOGII

– Material primit: broşaj, puncţie mamara, puncţie tiroidiana, lichid ascitic, lichid pleural, lichid sinovial, urina, frotiuri cervicovaginale.

Frotiu gata intins :   1.Uscare

                             2.Fixare-alcool etilic 96 sau alcool metilic

                             3.Uscare

                             4.Colorare Giemsa, HE, Papanicolaou

Recipient cu produs patologic:  

                              1.Centrifugare

                                 2.Intindere frotiuri

                               3.Uscare

                               4.Fixare-alcool etilic 96 sau alcool metilic

                               5.Uscare

                               6.Colorare Giemsa, HE

 

Coloraţii: se pot folosi reactivi preparaţi din pulberi sau kit-uri gata preparate. Timpii şi concentraţiile menţionate în reţete sunt orientative şi se adaptează în funcţie de condiţiile locale (temperatură ambientală, duritatea şi pH-ul apei de robinet etc). Coloraţia este considerată corectă dacă se obţin rezultatele preconizate

1. COLORATII UZUALE

1.1. Coloratia hematoxilina-eozina

1. Deparafinare
2. Hematoxilină Mayer – 2-5 minute

III. Spălare

1. Diferenţiere   rapidă în alcool-acid clorhidric
2. Spălare
3. Eozină 10-15 secunde

VII. Deshidratare trei bai de alcool etilic (70°, 96°, absolut)

VIII. Clarificare – 3-5 bai toluen

1. Montare.

Reactivi:

Hematoxilina Mayer: hematoxilina 1.5 g+alaun de potasiu 75g+iodat de sodiu 0.3g+apa distilata 1 litru.

Eozina: eozina galbena 6g+eozina albastra 6g+orange G 0.4g+alcool etilic 70° 700 ml+solutia carbonat de litiu 80 ml+acid acetic glacial 3 ml.

Alcool-acid clorhdric: 99 ml alcool etilic 70°+1 ml acid clorhidric 1N

Rezultate: nucleii-albastru, citoplasma-rosu.

2. COLORATII SPECIALE

2.1 Coloratia Van Gieson

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Spalare

1. Colorare cu hematoxilină Weigert (2 părţi hematoxilină + 1 parte mordant) – 5 minute
2. Spalare
3. Diferentiere rapida in alcool-acid clorhidric.

VII. Spalare

VIII. Contrastare în solutie saturata de Li₂CO₃

1. Spalare
2. Colorare cu picrofucsină – 2-5 minute
3. Spalare

XII. Deshidratare

XIII. Clarificare

XIV. Montare

Reactivi:

Hematoxilină Weigert: 99ml alcool 96^oC+ 1g hematoxilină la termostat timp de 24 ore

Mordant: 4 ml solutie hexaclorohidrat de fier trivalent 29%+1 ml acid clorhidric 1N+95 ml apa distilata

Picrofucsină: 100 ml acid picric solutie suprasaturata+10 ml fucsină acidă 1%

rezultat :nucleii-negri, citoplasma-galben, colagen-rosu

2.2. Coloratia Periodic Acid Schiff (PAS)

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Apă distilată

1. Oxidare cu acid periodic 0,5-1% – 5 -10minute
2. Apă distilată
3. Reactiv Schiff – 5-15 minute

VII.  Apă robinet – 10 minute

1. Hematoxilină Mayer – 2-5 minute

XII. Apă robinet

XIII. Contrastare în solutie saturata de Li₂CO₃

XIV. Apă robinet

1. Deshidratare

XVI. Clarificare

XVII. Montare

Reactivi:

Reactiv Schiff– se aduc 100ml apă distilată la fierbere. Se dizolvă 0,5g fuxină bazică mojarată (diamant fuxină). Se răceşte la 50^oC şi se adaugă 10ml acid clorhidric 1N. Se răceşte la 25^oC şi se adaugă 0,5g metabisulfit de natriu sau potasiu. Se etanşează vasul, se înveleşte în hârtie neagră şi se păstrează 24h la întuneric (la temperatura camerei sau la frigider la 4^oC). A doua zi se adaugă 0,5-1 g cărbune activ, se agită şi se lasă 2 minute în repaus. Se filtrează. Se păstrează în sticle brune la frigider. Culoarea reactivului trebuie să fie de la galben pai la incolor.

* Vasele trebuie sa fie clătite cu apă distilată şi perfect uscate; nu se lucrează în atmosferă de formol.

Rezultate: nuclei-albastru, polizaharide sau complex de polizaharide – magenta, membrane bazale – roşu

2.3 Coloratia Giemsa

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Apă distilată

1. Giemsa (1 parte Giemsa – KIT/ 4 părţi apă) –20-30 minute
2. Spălare în apă distilată în care se pun 7-8 picături de acid acetic glacial la 100 ml apă distilată
3. Diferenţiere cu alcool 96% (până preparatul devine roz)

VII. Deshidratare si clarificare in alcool   izopropilic

1. Clarificare în toluen
2. Montare

Rezultate: nuclei – violet, citoplasma bazofilă – albastru, citoplasma acidofila – roşu, mastocite – violet, Helicobacter pilori – albastru închis

2.4 Coloratia Perls

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Apă distilată

1. Imersie în soluţie: – sol. ferocianură de potasiu 2%

                                        – sol. acid clorhidric 2%

(raport sol. = 1/1 incubare timp de 30 minute, 56-60 grade C)

1. Apă distilată 10 minute
2. Supracolorare cu Kernechtrot – 3 minute sau

                                         fuxină acidă 1% – 1 minut sau

                                           roşu neutru 1% – 5 minute

VII. Spălare

VIII. Deshidratare

1. Clarificare
2. Montare

Reactivi

Se prepară extemporaneu 1,5g ferocianură de potasiu în 75 ml apă distilată şi 48ml acid clorhidric 1N cu 27ml apă distilată.

Rezultate: depozite de fier – albastru, nuclei – rosu     

2.5. Coloratia Ziehl-Nielsen

1. Deparafinare /Imersia frotiului în apă distilată
2. Carbolfucsină – 10-20 minute (incalzire la intervale de timp egale pana la emisia de vapori)
3. Spălare

III.  Tratare cu decolorant acid-alcool 3 minute

1. Spălare
2. Contracolorare cu solutie albastru de metilen 1% sau verde lumină 30-60 secunde
3. Spalare

VII.  Deshidratare

VIII.  Clarificare

1. Montare.

Rezultate: bacili alcoolo-rezistenti-rosii, fond – albastru sau verde

2.6 Coloratia Masson

1. Deparafinare

II.Apă distilată

III. Hematoxilină Weigert – 7-10 minute

1. Spălare – în apă , Li₂CO₃ – 5 secunde
2. Ponceau fucsină – 4 minute

(2 părţi Ponceau 1%, 1 parte fuxină acidă 1%, 1 parte acid acetic glacial)

VI.Spălare (în apă distilată)

VI.Acoperire cu acid fosfomolibdenic 1%- 10 minute

VII. Anilină orange sau verde lumină – 5 minute (lama nu se spală înainte)

VIII.  Spălare (în apă distilată)

1. Deshidratare – rapidă (în alcool absolut 1%)
2. Clarificare
3. Montare

Reactivi:

Ponceau 1%: Roşu Ponceau 1 g în 99 ml apă distilată

Fucsină acidă 1%: 1 g fucsină acidă în 99 ml apă distilată

Acid fosfomolibdenic 1%: 1 g acid fosfomolibdenic în 99 ml apă distilată

Anilin orange: 0,5g anilină blue, 2g orange G, 2,5 ml acid acetic glacial, 95 ml apă distilată

verde lumina: 0,1g.verde lumina in 100ml.acid acetic 1%.

Rezultate : nucleii – albaştri (negri), colagen, mucus – albastru /verde, citoplasma – roşu-cărămiziu, eritrocite – roşu-portocaliu

2.7. Coloratia Gömöri

1. Deparafinare
2. Hidratare

III.  Apă

IV.Oxidare – cu permanganat de potasiu 1% (se filtrează)

1. Spălare
2. Decolorare rapida – cu metabisulfit de natriu sau potasiu 2%

VII. Spălare

VIII.Mordansare – cu alaun feriamoniacal 2%- 2 minute

1. Spălare
2. Impregnare – cu soluţie argento- amoniacală (Tollens)
3. Apă distilată – 2 băi rapide

XII.  Reducere – formol neutru 10%

XIII. Apă

XIV. Reducere – cu metabisulfit de natriu/potasiu 2%- 1 minut – facultativ

1. Apă

XVI. Fixare – tiosulfat de natriu 1%- 1 minut

XVII. Spălare

XVIII. Deshidratare

XIX.Clarificare

1. Montare

Reactivi:

Soluţia extemporaneu argento-amoniacală (Tollens): se cântăresc 500mg AgNO₃+ 5ml apă distilată+ 1 ml hidroxid de natriu 10%+ sol. amoniac (picătură cu picătură) până la dizolvarea completă a precipitatului. Se dublează volumul soluţiei cu apă distilată.

Rezultate: fibrele de reticulina – negru-brun

2.8. Coloratia Rosu de Congo

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Spălare

1. Colorare cu soluţie Roşu de Congo 0,5% – 10-30 minute
2. Spălare în apă distilată
3. Diferenţiere în soluţie KOH/ NaOH   0,2%

VII. Spălare apă distilată

VIII.Hematoxilină – 2-5 minute

1. Spălare
2. Contrastare în soluţie suprasaturată de Li₂CO₃
3. Spălare

XII.  Deshidratare

XIII. Clarificare

XIV.  Montare

Reactivi:

Soluţie Roşu de Congo 0,5%: 0,5g Roşu de Congo în 100 ml alcool etilic 50%

Rezultate: nuclei – albaştri, amiloid – roşu cărămiziu (birefringenţă verde în lumină polarizată)

2.9. Coloratia Van Gieson elastic

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Imersie rapida in alcool etilic 96 ^o

1. Imersie – sol rezorcină- fucsină (30 minute – 1h)
2. Spălare apă distilată
3. Diferenţiere (alcool 96^o)

VII. Coloraţia Van Gieson

Rezultate: fibre elastice – negru, nuclei – negru, colagen – roşu, muschi – galben

2.10 Coloratia Albastru Alcian

1. Deparafinare
2. Hidratare

III. Solutie Albastru alcian – 20 minute

1. Spalare
2. Contracolorare cu Hematoxilina Mayer – 2-5 minute
3. Spalare

VII. Diferentiere rapida cu alcool-acid clorhidric

VIII.Spalare

1. Deshidratare

X.Clarificare

1. Montare

Reactivi:

Solutie Albastru alcian pH 1:Albastru alcian 8GX 1g+99 ml apa distilata+acid clorhidric 1N pana la pH 1.

Solutie Albastru alcian pH 2,5: Albastru alcian 8GX 1g+50 ml alcool etilic absolut+50 ml apa distilata+ acid acetic glacial pana la pH 2,5

Rezultate: nuclei – albastru, polizaharide acide   – albastru

2.11. Coloratia Papanicolaou

1. Hidratare
2. Spalare

III.  Hematoxilina Harris –   1-5 minute

1. Spalare
2. Diferentiere – acid clorhidric 0,25% (10-20 secunde)
3. Spalare

VII.  Orange G – 30 secunde – 4 minute

VIII. Alcool etilic 96 ^o – 2 minute

1. EA50 sau EA51– 1-15 minute
2. Alcool 96 ^o – doua bai de 3, respective 2 minute
3. Alcool etilic absolut 2 minute

XII.  Clarificare

XIII.Montare

2.12. Coloratia Masson-Fontana

1. Deparafinare
2. Hidratare.

      III. Spalare

1. Imersie timp de 8-24 h la intuneric in solutie argento-amoniacala
2. Spalare
3. Fixare cu tiosulfat de sodiu 0,5-1% 50-60 secunde

      VII. Spalare.

      VIII. Contracolorare cu solutie fucsina acida 0,1% 30-60 secunde

`    IX. Uscare

1. Clarificare
2. Montare

Reactivi: solutie argento-amoniacala: 5 ml solutie azotat de argint 10%+hidroxid de amoniu 25% pana la disparitia precipitatului de oxid de argint+azotat de argint 10% pana la opalescenta. Se aduce la 50 ml cu apa distilata.

Rezultate: pigment melanic, hemosiderină – negru

2.13. Coloratia Gram

1. Deparafinare
2. Hidratare.

      III. Violet de gentiana 1% – 1 minut.

1. Spalare
2. Solutie Lugol – 2 minute
3. Decolorare cu alcool-acetona.

      VII. Contracolorare cu solutie fucsina bazica 0,1% – 1 minut

      VIII. Uscare

1. Clarificare
2. Montare

Reactivi: Kit de colorare.

Preparare: Violet de gentiana 1g.+100ml.apa distilata

                 Solutie Lugol:iodura de potasiu 1g+iod 1g.+300ml.apa distilata

                 solutie fucsina bazica :carbofuxina 1ml.+alcool absolut 10ml.+apa distilata 50ml.

Rezultate: bacterii gram negative – rosu, bacterii gram pozitive – albastru

PROTOCOL DE LUCRU EXAMENUL EXTEMPORANEU

1. Se verifică documentele de insotire a fragmentului tisular şi fragmentul tisular similar protocolului de lucru pentru prelucrare histopatologică. În plus se verifica daca fragmentul tisular este de dimensiuni suficiente examenului extemporaneu
2. se înregistrează cazul
3. se orientează macroscopic piesa; se dimensioneaza si se descrie fragmentul tisular; se preleveaza fragmente tisulare pentru examenul extemporaneu
4. se congelează fragmentului tisular – se monteaza fragmentul tisular pe suportul metalic şi se îngheaţă în criostat la temperatură sub minus 40°C până devine perfect opac
5. se secţionează la criomicrotom – se niveleaza blocul tisular îngheţat, efectuandu-se sectiuni la 2-10μ
6. Sectiunile obtinute se etalează pe lame de sticla cu ajutorul unui port-ac sau direct cu ajutorul plăcţei anti-rol
7. Lamele cu material histopatologic sectionat la gheata se coloreaza cu hematoxilină-eozină sau solutie de albastru de toluidina (coloratii uzuale) sau Scharlach (coloratie speciala pentru lipide).
8. Se monteaza în apă, glicerină sau medii de montare solubile în solvenţi organici

Protocol de lucru imunohistochimie

(metoda tristadială indirectă, evidenŢiere cu DAB)

1. deparafinare
2. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
3. pretratamente – în funcţie de specificaţiile fiecărui anticorp primar.
4. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
5. inhibarea peroxidazei endogene (Hydrogen Peroxide 3%), timp de 15 min
6. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
7. blocarea antigenicităţii nespecifice cu protein block după recomandările producătorului
8. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
9. anticorp primar în cameră umedă la temperatura camerei – în funcţie de specificaţiile fiecărui anticorp primar.
10. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
11. anticorp secundar biotinilat antispecie după recomandările producătorului
12. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
13. streptavidin complex (streptavidin peroxidase), după recomandările producătorului
14. spălare cu tampon TBS sau PBS, pH 7.4, 10-20 min (2-3 băi)
15. developare cu diaminobenzidină DAB 5-15 minute în funcţie de virarea culorii
16. spălare apă de robinet
17. contracolorare cu hemalaun Meyer, urmată de deshidratare şi uscare montare